Jaunumi — izšķīdušā skābekļa līmeņa monitorings biofarmaceitiskās fermentācijas procesā

Kas ir izšķīdušais skābeklis?

Izšķīdušais skābeklis (DO) attiecas uz molekulāro skābekli (O_₂), kas ir izšķīdis ūdenī. Tas atšķiras no skābekļa atomiem, kas atrodas ūdens molekulās (H_₂O), jo tas ūdenī pastāv neatkarīgu skābekļa molekulu veidā, kas vai nu nāk no atmosfēras, vai arī rodas fotosintēzes procesā ūdensaugos. DO koncentrāciju ietekmē dažādi faktori, tostarp temperatūra, sāļums, ūdens plūsma un bioloģiskās aktivitātes. Tādējādi tas kalpo kā kritisks rādītājs ūdens vides veselības un piesārņojuma stāvokļa novērtēšanai.

Izšķīdušajam skābeklim ir būtiska loma mikrobu metabolisma veicināšanā, ietekmējot šūnu elpošanu, augšanu un vielmaiņas produktu biosintēzi. Tomēr augstāks izšķīdušā skābekļa līmenis ne vienmēr ir labvēlīgs. Pārmērīgs skābeklis var izraisīt uzkrāto produktu turpmāku metabolismu un potenciāli izraisīt toksiskas reakcijas. Optimālais DO līmenis dažādām baktēriju sugām atšķiras. Piemēram, penicilīna biosintēzes laikā DO parasti tiek uzturēts aptuveni 30% gaisa piesātinājuma līmenī. Ja DO samazinās līdz nullei un paliek šajā līmenī piecas minūtes, produktu veidošanās var ievērojami pasliktināties. Ja šis stāvoklis saglabājas 20 minūtes, var rasties neatgriezeniski bojājumi.

Pašlaik visbiežāk izmantotie DO sensori var izmērīt tikai relatīvo gaisa piesātinājumu, nevis absolūto izšķīdušā skābekļa koncentrāciju. Pēc barotnes sterilizācijas tiek veikta aerācija un maisīšana, līdz sensora rādījums stabilizējas, un tad vērtība tiek iestatīta uz 100% gaisa piesātinājuma. Turpmākie mērījumi fermentācijas procesa laikā tiek veikti, pamatojoties uz šo atsauci. Absolūtās DO vērtības nevar noteikt, izmantojot standarta sensorus, un tām ir nepieciešamas modernākas metodes, piemēram, polarogrāfija. Tomēr gaisa piesātinājuma mērījumi parasti ir pietiekami, lai uzraudzītu un kontrolētu fermentācijas procesus.

Fermentatora ietvaros DO līmeņi dažādos reģionos var atšķirties. Pat ja kādā brīdī tiek iegūts stabils rādījums, noteiktās barotnēs joprojām var rasties svārstības. Lielākiem fermentatoriem ir tendence uzrādīt lielākas DO līmeņu telpiskās variācijas, kas var būtiski ietekmēt mikrobu augšanu un produktivitāti. Eksperimentāli pierādījumi liecina, ka, lai gan vidējais DO līmenis var būt 30%, fermentācijas veiktspēja svārstīgos apstākļos ir ievērojami zemāka nekā stabilos apstākļos. Tāpēc fermentatoru mērogošanā — papildus ģeometriskās un jaudas līdzības apsvērumiem — telpisko DO variāciju samazināšana joprojām ir galvenais pētniecības mērķis.

Kāpēc izšķīdušā skābekļa monitorings ir būtisks biofarmaceitiskajā fermentācijā?

1. Uzturēt optimālu augšanas vidi mikroorganismiem vai šūnām
Rūpnieciskajā fermentācijā parasti tiek iesaistīti aerobie mikroorganismi, piemēram, Escherichia coli un raugs, vai zīdītāju šūnas, piemēram, Ķīnas kāmja olnīcu (CHO) šūnas. Šīs šūnas fermentācijas sistēmā darbojas kā "darbinieces", kurām elpošanai un vielmaiņas aktivitātei nepieciešams skābeklis. Skābeklis aerobajā elpošanā kalpo kā terminālais elektronu akceptors, ļaujot ražot enerģiju ATP veidā. Nepietiekama skābekļa padeve var izraisīt šūnu nosmakšanu, augšanas apstāšanos vai pat šūnu nāvi, kas galu galā noved pie fermentācijas neveiksmes. DO līmeņa uzraudzība nodrošina, ka skābekļa koncentrācija saglabājas optimālā diapazonā ilgstošai šūnu augšanai un dzīvotspējai.

2. Nodrošināt mērķa produktu efektīvu sintēzi
Biofarmaceitiskās fermentācijas mērķis nav tikai veicināt šūnu proliferāciju, bet arī atvieglot vēlamo mērķa produktu, piemēram, insulīna, monoklonālo antivielu, vakcīnu un enzīmu, efektīvu sintēzi. Šiem biosintēzes ceļiem bieži vien ir nepieciešams ievērojams enerģijas patēriņš, kas galvenokārt tiek iegūts no aerobās elpošanas. Turklāt daudzas produktu sintēzē iesaistītās fermentatīvās sistēmas ir tieši atkarīgas no skābekļa. Skābekļa deficīts var traucēt vai samazināt šo ceļu efektivitāti.

Turklāt DO līmeņi darbojas kā regulējošs signāls. Gan pārmērīgi augsta, gan zema DO koncentrācija var:
- Mainīt šūnu vielmaiņas ceļus, piemēram, pārejot no aerobās elpošanas uz mazāk efektīvu anaerobo fermentāciju.
- Izraisa šūnu stresa reakcijas, kas noved pie nevēlamu blakusproduktu ražošanas.
- Ietekmēt eksogēno olbaltumvielu ekspresijas līmeņus.

Precīzi kontrolējot DO līmeni dažādos fermentācijas posmos, ir iespējams virzīt šūnu metabolismu uz maksimālu mērķa produkta sintēzi, tādējādi panākot augsta blīvuma un augstas ražas fermentāciju.

Ievads biofarmaceitisko produktu ūdens plūsmas shēmā

3. Lai novērstu skābekļa deficītu vai pārmērīgu tā daudzumu
Skābekļa trūkumam (hipoksijai) var būt nopietnas sekas:
- Šūnu augšana un produktu sintēze apstājas.
- Metabolisms pāriet uz anaerobo ceļu, kā rezultātā uzkrājas organiskās skābes, piemēram, pienskābe un etiķskābe, kas pazemina barotnes pH līmeni un var saindēt šūnas.
- Ilgstoša hipoksija var izraisīt neatgriezeniskus bojājumus, un atveseļošanās nav pilnīga pat pēc skābekļa piegādes atjaunošanas.

Pārmērīgs skābekļa daudzums (pārsātinājums) rada arī riskus:
- Tas var izraisīt oksidatīvo stresu un reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos, kas bojā šūnu membrānas un biomolekulas.
- Pārmērīga aerācija un maisīšana palielina enerģijas patēriņu un ekspluatācijas izmaksas, radot nevajadzīgu resursu izšķērdēšanu.

4. Kā kritisks parametrs reāllaika uzraudzībai un atgriezeniskās saites kontrolei

DO ir reāllaika, nepārtraukts un visaptverošs parametrs, kas atspoguļo fermentācijas sistēmas iekšējos apstākļus. DO līmeņa izmaiņas var jutīgi norādīt uz dažādiem fizioloģiskiem un darbības stāvokļiem:
- Strauja šūnu augšana palielina skābekļa patēriņu, izraisot DO līmeņa pazemināšanos.
- Substrāta noplicināšanās vai inhibīcija palēnina vielmaiņu, samazinot skābekļa patēriņu un izraisot DO līmeņa paaugstināšanos.
- Piesārņojums ar svešiem mikroorganismiem maina skābekļa patēriņa modeli, izraisot patoloģiskas DO svārstības un kalpojot kā agrīns brīdinājuma signāls.
- Iekārtu darbības traucējumi, piemēram, maisītāja atteice, ventilācijas cauruļu aizsprostojums vai filtra aizsērēšana, var izraisīt arī neparastu DO darbību.

Integrējot DO monitoringu reāllaikā automatizētā atgriezeniskās saites vadības sistēmā, precīzu DO līmeņu regulēšanu var panākt, dinamiski pielāgojot šādus parametrus:
- Maisīšanas ātrums: ātruma palielināšana uzlabo gāzes un šķidruma kontaktu, sadalot burbuļus, tādējādi uzlabojot skābekļa pārneses efektivitāti. Šī ir visbiežāk izmantotā un efektīvākā metode.
- Aerācijas ātrums: ieplūdes gāzes plūsmas ātruma vai sastāva regulēšana (piemēram, gaisa vai tīra skābekļa proporcijas palielināšana).
- Tvertnes spiediens: paaugstināts spiediens palielina skābekļa parciālo spiedienu, tādējādi uzlabojot šķīdību.
- Temperatūra: Temperatūras pazemināšana palielina skābekļa šķīdību barotnē.

BOQU produktu ieteikumi bioloģiskās fermentācijas tiešsaistes uzraudzībai: